KIS Ústecký kraj
Projekt Krajského informačního střediska pro rozvoj zemědělství a venkova Ústeckého kraje vznikl za podpory Ministerstva zemědělství

Stanovení lipoxidázy v pšeničném klíčku

23/05/07

Zdroj: ÚZPI

Metoda měření lipoxidázové aktivity v přírodním pšeničném klíčku zahrnuje homogenizaci surového pšeničného klíčku, extrakci enzymu a inaktivaci lipoxidázy zahříváním na 130 °C po dobu 10 minut.

Lipoxidáza, která je obsažena v pšeničném klíčku a ovlivňuje jeho kvalitu se musí před dalším zpracováním zrna inaktivovat. Pšeničný klíček je tvořen z více než 10 % olejem, z čehož 84 % představují nenasycené mastné kyseliny. Mimoto obsahuje řadu dalších komponent jako jsou fosfolipidy, glutathion, tokoferol, oktakosanol a flavony. Protein pšeničného klíčku zahrnuje více než 30 % veškerých esenciálních aminokyselin pšeničného zrna. Pšeničné klíčky se velmi obtížně skladují, protože poměrně rychle dochází k jejich oxidaci a žluknutí. Za hlavní faktor podílející se na tomto jevu je považována lipoxidáza v pšeničném klíčku, která katalyzuje oxidaci pšeničného oleje a způsobuje rychlé zvýšení peroxidové hodnoty. Nezbytnou podmínkou pro určení způsobu inaktivace lipoxidázy je vhodná metoda měření lipoxidázové aktivity v přírodním pšeničném klíčku. Nejčastěji používané dvě metody nejsou pro tyto účely příliš vhodné. U první z publikovaných metod měření aktivity purifikované lipoxidázy nedochází k úplnému zastavení enzymové činnosti a nadto je zapotřebí po celou dobu provádění přísné dodržování konstantní teploty. Druhá metoda používaná k měření lipoxidázové aktivity sójových bobů je pro pšeničné klíčky rovněž nevhodná, protože při ní sice dochází k inaktivaci sójové lipoxidázy, ovšem hladina pšeničné lipoxidázy zůstává vysoká a při měření způsobuje značné problémy. Protože tyto metody nejsou pro měření lipoxidázové aktivity přírodního pšeničného klíčku vhodné, byla vyvinuta alternativní metoda, která uvedené nedostatky odstraňuje.    

Materiály a přístroje

Použité čerstvé pšeničné klíčky byly získány od firmy Shanghai Flour Company Ltd. Kyselina linolová 99% čistoty obchodní značky Fluka-62230, resp. Fluka-93773 byla dodána společností Sigma-Aldrich. Dále byl použit UV-Vis spektrofotometr model UV-2100PC společnosti UNICO (Shanghai) Instruments Co., Ltd., elektronické váhy Precisa model XS225A, homogenizér (model SilentCrusher) od firmy S.Heidolph (Německo) a centrifuga model DL-5B z Institutu Shaghai Centrifuge Research.

Měření lipoxidázy v pšeničném zrnu

Odtučněný extrakt z pšeničných klíčků určené koncentrace v množství 0,3 ml byl přidán do 2 ml boritého pufru s pH 9,0, obsahujícího kyselinu linolovou v množství 2,24.10-3 mol/l. Teplota obou roztoků před smísením byla udržována na hodnotě 30 şC. Směs byla po dobu čtyř minut dále udržována na teplotě 30 şC a potom byla enzymová reakce ukončena přídavkem 2 ml 1,5 mol/l NaOH. Optická absorpce byla měřena při 234 nm.

Definování jednotky aktivity lipoxidázy pšeničného zrna

Ve výše uvedeném systému měření lipoxidázy je zvýšení optické absorpce o 0,001 vyvolané působením 1 gramu extraktu pšeničného klíčku za minutu definováno jako jedna jednotka enzymové aktivity (U).

Výsledky a diskuse

Stanovení lipoxidázové aktivity v pšeničných klíčcích je ovlivňováno několika faktory: odtučněním pšeničného klíčku, extrakcí lipoxidázy, koncentrací extraktu a zejména způsobem zakončení lipoxidázové reakce.

Odtučnění pšeničného klíčku

Jestliže se z pšeničného klíčku neodstraní tuk, bude kyselina linolová v něm obsažená katalyzována lipoxidázou během extrakce lipoxidázy, což se projeví vysokou optickou absorpcí v extraktu a znemožní měření enzymové aktivity. Tuky se musí z pšeničného klíčku odstranit v maximální míře, enzymová aktivita ale během tohoto procesu nesmí být ovlivněna. Vhodná metoda byla nalezena po mnoha experimentálních stanoveních. Pšeničné klíčky se drtí a filtrují sítem o hustotě 100-mesh. Získaný jemný prášek pšeničného klíčku se ponechá po dobu 12-4 hodin nasáknout v petroleteru při 30 şC. Petroleter se používá v množství, které odpovídá trojnásobku hmotnosti pšeničných klíčků. Odtučněné pšeničné klíčky se poté odfiltrují a petroleter se nechá odpařit při pokojové teplotě.

Extrakce lipoxidázy z pšeničných klíčků

Extrakt lipoxidázy z pšeničných klíčků se získává následovně: suspenze 1 g prášku z odtučněných klíčků ve vodě se protřepává po dobu 30 minut při teplotě 30 ş a poté se odstřeďuje 20 minut při 5 000 otáčkách za minutu. Získaný objem se použije jako enzymový roztok.

Při naředění 1 g enzymového extraktu na 10 ml vykazoval enzymový reakční systém vyšší koncentraci proteinu a nižší transparentnost a hodnota optické aktivity nevykazovala zřetelné změny. Při naředění enzymového extraktu na 50, resp. 100 ml se hodnota optické absorpce měnila relativně zřetelně. Pro analyzování aktivity enzymu, který byl částečně inaktivován tepelným opracováním byl enzymový extrakt naředěn na 50 ml. Obecně lze říci, že je pro extrakci proteinu užitečné přidání kroku homogenizace před protřepáváním.

Podmínky pro zastavení reakce lipoxidázy  pšeničného klíčku

Při analýze enzymové aktivity je nutné, aby enzymová aktivita mohla být v případě potřeby okamžitě zastavena. K ukončení reakce sójové lipoxidázy se používá přídavek bezvodého etanolu v objemu, který dvojnásobně převyšuje objem reakčního systému. U lipoxidázy pšeničného klíčku se ale optická absorpce kontinuálně zvyšuje dokonce i při přídavku pětinásobného množství bezvodého etanolu a nadto je zkreslována vznikajícími produkty. Běžnou metodou deaktivace enzymů je působení tepla. Aktivita sójové lipoxidázy je inhibována při teplotě vyšší než 85 şC, ovšem aktivita oxidázy pšeničného klíčku zůstává poměrně vysoká i při působení teploty 95 şC po dobu dvou minut. Dokonce i v případě, že byl lipoxidázový extrakt zahříván po dobu 3 minut ve vroucí vodě byla ještě enzymová aktivita prokazatelná. Vhodné podmínky pro zastavení reakce lipoxidázy pšeničného klíčku byly hledány poměrně dlouhou dobu. Bylo zjištěno, že enzymovou aktivitu je možno zastavit přídavkem 2 ml 1,5 mol/l NaOH. Mimoto byla pro tyto účely testována řada kovových iontů a organických rozpouštědel, ale žádná z těchto látek nedokázala reakci účinně zastavit. Koncentrace NaOH nižší než 1,5 mol/l lipoxiodázu pšeničného klíčku neinaktivuje, stejně tak není vhodná koncentrace NaOH vyšší než tato hodnota, protože destruuje emulgovaný substrát a vytváří zákal, takže analýzu není možno provést.

Extrakt lipoxidázy z pšeničných klíčků se získává následovně: suspenze 1 g prášku z odtučněných klíčků ve vodě se protřepává po dobu 30 minut při teplotě 30 ş a poté se odstřeďuje 20 minut při 5 000 otáčkách za minutu. Získaný objem se použije jako enzymový roztok. Vliv koncentrace lipoxidázového extraktu na měření enzymové aktivity ukazuje tabulka 1, z které je zřejmé, že zvýšená enzymová aktivita koreluje se zvýšenou absorpcí.

Tab. 1: Optická absorpce (234 nm) při různých koncentracích lipoxidázového extraktu

Při naředění 1 g enzymového extraktu na 10 ml vykazoval enzymový reakční systém vyšší koncentraci proteinu a nižší transparentnost a hodnota optické aktivity nevykazovala zřetelné změny. Při naředění enzymového extraktu na 50, resp. 100 ml se hodnota optické absorpce měnila relativně zřetelně. Pro analyzování aktivity enzymu, který byl částečně inaktivován tepelným opracováním byl enzymový extrakt naředěn na 50 ml. Obecně lze říci, že je pro extrakci proteinu užitečné přidání kroku homogenizace před protřepáváním. Vliv homogenizace na aktivitu lipoxidázy extraktu pšeničného klíčku ukazuje tabulka 2.

Tab. 2: Vliv doby homogenizace na aktivitu lipoxidázového extraktu z pšeničného klíčku (2% ředění)*

Ředění: 1 g enzymového extraktu naředěno na 50 ml

Tabulka 2 ukazuje, že enzymová aktivita dosahuje velmi rychle vrcholu a zůstává konstantní ve vzorcích homogenizovaných 90 sekund. To pravděpodobně znamená, že lipoxidáza pšeničného klíčku má tendenci inaktivovat působením střihových sil při vysoké rychlosti ve vodném roztoku. Drcení pšeničného klíčku enzymovou aktivitu neovlivňuje, protože odtučněné pšeničné klíčky procházející sítem 60, 80 a 100 mesh mají téměř stejnou enzymovou aktivitu. Zvýšená koncentrace proteinu rovněž nebyla prokázána jako hlavní faktor.

Podmínky pro zastavení reakce lipoxidázy  pšeničného klíčku

Při analýze enzymové aktivity je nutné, aby enzymová aktivita mohla být v případě potřeby okamžitě zastavena. K ukončení reakce sójové lipoxidázy se používá přídavek bezvodého etanolu v objemu, který dvojnásobně převyšuje objem reakčního systému. U lipoxidázy pšeničného klíčku se ale optická absorpce kontinuálně zvyšuje dokonce i při přídavku pětinásobného množství bezvodého etanolu a nadto je zkreslována vznikajícími produkty. Běžnou metodou deaktivace enzymů je působení tepla. Aktivita sójové lipoxidázy je inhibována při teplotě vyšší než 85 şC, ovšem aktivita oxidázy pšeničného klíčku zůstává poměrně vysoká i při působení teploty 95 şC po dobu dvou minut. Dokonce i v případě, že byl lipoxidázový extrakt zahříván po dobu 3 minut ve vroucí vodě byla ještě enzymová aktivita prokazatelná. Vhodné podmínky pro zastavení reakce lipoxidázy pšeničného klíčku byly hledány poměrně dlouhou dobu. Bylo zjištěno, že enzymovou aktivitu je možno zastavit přídavkem 2 ml 1,5 mol/l NaOH. Mimoto byla pro tyto účely testována řada kovových iontů a organických rozpouštědel, ale žádná z těchto látek nedokázala reakci účinně zastavit. Koncentrace NaOH nižší než 1,5 mol/l lipoxiodázu pšeničného klíčku neinaktivuje, stejně tak není vhodná koncentrace NaOH vyšší než tato hodnota, protože destruuje emulgovaný substrát a vytváří zákal, takže analýzu není možno provést.

Lineární oblast pro měření aktivity lipoxidázy pšeničného klíčku

Optická absorpce A234 lipoxidázy pšeničného klíčku za výše popsaných enzymových podmínek byla 0,052 při 1 minutě, 0,137 při 2 min., 0,237 při 3 min., 0,339 při 4 min., 0,406 při 5 min., 0,469 při 6 min. 0,518 při 7 min. a 0,562 při 8 min. Enzymové působení lipoxidázy pšeničného klíčku bylo po dobu 5 minut lineární a může být popsáno následující rovnicí

      y = 0,091x -0,0388 R2 =0,9959

Směrnice přímky byla 0,091 což znamená, že A234 se zvyšovala o 0,091 za minutu. Protože 1 gram extraktu pšeničného klíčku byl naředěn na 50 ml, je podle definice jednotky aktivity testovaná aktivita (A) lipoxodázy pšeničného klíčku

    A = 0,091 x 1 000 x 50 = 4,550 U.

Inaktivace lipoxidázy pšeničného klíčku tepelným opracováním

Lipoxidáza přírodního pšeničného klíčku je natolik termotolerantní, že je velmi obtížné ji inaktivovat. Bylo proto nuné nalézt vhodné teplotní podmínky, při kterých je možno lipoxidázu inaktivovat. Při zahřívání pšeničného klíčku na teplotu od 110 do 140 şC se sice procento zůstatkové lipoxidázové aktivity snižovalo, ale protože má pšeničný klíček při zahřívání na teplotu vyšší než 140 şC tendenci se spálit, byly jako nejvhodnější podmínky zahřívání pro inaktivaci lipoxidázy pšeničného klíčku stanoveny 10 minut při teplotě 130ş C.

Závěr

Byla vyvinuta metoda měření lipoxidázové aktivity v přírodním pšeničném klíčku, která zahrnuje jako rozhodující krok homogenizaci surového pšeničného klíčku po dobu 90 sekund, čímž se zlepší extrakce enzymu. Zastavení aktivity lipoxidázy pšeničného klíčku bylo dosaženo směšováním NaOH a reakčního enzymového roztoku v poměru 2 ml NaOH (1,5 mo,l/l) ku 2,3 ml roztoku. Lipoxidáza pšeničného klíčku byla inaktivována zahříváním surového pšeničného klíčku na 130 °C po dobu 10 minut.